الکتروفورز

از بهترین و کاربردی‌ترین روش‌های جداسازی می‌باشد.

تعریف: مهاجرت چندین مولکول باردار تحت یک میدان الکتریکی که به جدا شدن آن‌ها از هم منتهی می‌شود.

کاربرد این روش در تعیین تعداد زیر واحدهای یک درشت مولکول، جرم مولکولی نسبی آن و در مورد پروتئین‌ها بررسی حالت طبیعی آن‌ها می‌باشد.

شماتیک الکتروفورز افقی

این روش اولین بار دهه چهارم قرن نوزدهم میلادی، توسط آرنه تیسلوس (Arne Tiselius)، دانشمند سوندی برای جداسازی پروتئین‌ها به کار رفت. کلیت آن این است که در یک محیط مایع یا نیمه جامد مثل ژله، با اعمال پتانسیل الکتریکی ذرات و ترکیبات مختلف زیستی مثل پروتئین‌ها و پلی نوکلئوتیدها را بین دو قطب مثبت و منفی الکتریکی، از هم جدا می‌کنیم. اگر بار الکتریکی مولکول مثبت باشد به سمت قطب منفی و اگر بار الکتریکیش منفی بود به طرف قطب مثبت می‌رود.

الکتروفورز تنوع زیادی دارد که تئوری همه‌شان یک چیز است. هرگاه ذره باردار  qرا در میدان الکتریکی با قدرت E بگذاریم، نیروی F به آن وارد می‌شود و بین این سه پارامتر، رابطه زیر وجود دارد:

F=qE

یعنی نیروی وارد شده به ذره از طرف میدان برابر با حاصل ضرب بار ذره در قدرت میدان است. طبق قانون سوم نیوتن در مقابل این نیرو که به آن «پیش برنده الکتروفورزی» می‌گویند، نیروی مخالفی به نام نیروی «اصطکاک» وجود دارد:

F_f = f.V

F_f  نیروی اصطکاک مقابله کننده با حرکت مولکول، V سرعت ذره باردار و f ضریب اصطکاک محیط است. ضریب اصطکاک محیط در واقع بیک ثابت است که دارد از تحرک ذره کم می‌کند.

شماتیک الکتروفورز افقی

انواع الکتروفورز بر اساس بستر

محیطی که درون آن، نمونه ما جدا می‌شود (محیط جداسازی) می‌تواند مایع، جامد و ژله‌ای باشد. پس بر این اساس الکتروفورزها ۳ دسته‌اند.

الکتروفورز کاغذی

در الکتروفورز کاغذ، میدان الکتریکی روی یک تکه کاغذ جاذب اعمال می‌شود. همانطور که جریان الکتریکی از کاغذ عبور می‌کند، مولکول‌های موجود در یک نمونه، مانند پروتئین‌ها یا قطعات DNA، بسته به اندازه و بار خود با سرعت‌های متفاوتی حرکت می‌کنند. مولکول‌های دارای بار مثبت به سمت الکترود منفی (کاتد) و مولکول‌های دارای بار منفی به سمت الکترود مثبت (آند) می‌روند.

کاغذ با یک محلول بافر مناسب مرطوب می‌شود که pH ثابتی را در طول فرآیند حفظ می‌کند. الکترودها به منبع تغذیه متصل می‌شوند و در دو انتهای کاغذ قرار می‌گیرند. نمونه‌ها به صورت لکه‌ها یا نوارهای کوچک روی کاغذ اعمال می‌شوند. پس از اعمال جریان الکتریکی، مولکول‌های موجود در نمونه‌ها شروع به مهاجرت می‌کنند. مولکول‌های کوچک‌تر یا با بار بیش‌تر سریع‌تر از مولکول‌های بزرگ‌تر یا کم بار حرکت می‌کنند. پس از الکتروفورز، کاغذ خشک می‌شود و اجزای جدا شده با استفاده از روش‌های مختلف رنگ آمیزی بسته به نوع مولکول‌ها مشاهده می‌شوند. فاصله مهاجرت هر جزء از نقطه اصلی اندازه‌گیری شده و برای تجزیه و تحلیل بیشتر استفاده می‌شود.

الکتروفورز ژلی

ژل‌های آن دو نوع عمده‌ی پلی اکریل آمید و آگارز می‌باشد. در الکتروفورز ژل، مولکول‌ها بر اساس اندازه، شکل و بار جدا می‌شوند. یک میدان الکتریکی اعمال می‌شود که باعث می‌شود مولکول‌های باردار از طریق یک ژل مهاجرت کنند. مولکول‌های کوچک‌تر سریع‌تر حرکت می‌کنند و دورتر از مولکول‌های بزرگ‌تر قرار می‌گیرند و امکان جداسازی آن‌ها فراهم می‌شود. ژل آگارز برای قطعات DNA بزرگتر استفاده می‌شود، در حالی که ژل پلی آکریل آمید برای قطعات DNA و پروتئین‌های کوچکتر مناسب است.

ژل آگارز برای جداسازی و تجزیه و تحلیل ماکرومولکول‌ها، ژل دارای چاه‌هایی در بالای آن است که نمونه‌ها در آن بارگذاری شده‌اند و تا حدودی به سمت پایین کشیده شده و به نوارهای مجزا از هم جدا شده‌اند.

انواع الکتروفورز: افقی و عمودی

معمولاً الکتروفورز با آگارز افقی و با پلی اکریل آمید عمودی است. تفاوتشان این است که در الکتروفورز عمودی نیروی گرانش اثر بیش‌تری از خودش نشان می‌دهد و در جداسازی نمونه‌های با وزن کم تأثیر گذار است و راندمان تفکیک را بالا می‌برد.

1- ژل آگارز دارای چندین ویژگی مهم است:

• ژل آگارز یک محیط متداول در الکتروفورز ژل برای جداسازی DNA، RNA و پروتئین‌های بزرگ است.
• این ماده از آگار، ماده‌ای که از انواع خاصی از جلبک دریایی استخراج می‌شود، به دست می‌آید.
• اندازه منافذ ژل آگارز را می توان با تغییر غلظت آگارز کنترل کرد.
• ژل آگارز با حرارت دادن پودر آگارز در محلول بافر تهیه می‌شود تا محلولی مایع ایجاد شود که با سرد شدن تا دمای اتاق یا کمتر جامد می‌شود. این برگشت پذیری حرارتی، کار و آماده سازی آن را آسان می‌کند.
• آگارز از نظر شیمیایی بی اثر است، به این معنی که با نمونه ها واکنش نشان نمی دهد یا در فرآیند الکتروفورز دخالت نمی کند.
• ژل‌های آگارز انعطاف پذیر هستند و خطر ترک خوردن یا شکستن را کاهش می‌دهند، که به ویژه هنگام استخراج قطعات DNA برای آنالیز بسیار مهم است.
• ژل مانند غربال مولکولی عمل می‌کند. قطعات DNA بزرگتر آهسته‌تر از طریق ماتریس ژل حرکت می‌کنند، در حالی که قطعات کوچک‌تر سریع‌تر حرکت می‌کنند که امکان جداسازی موثر بر اساس اندازه را فراهم می‌کند.
• آگارز غیر سمی و زیست سازگار است و استفاده از آن در محیط آزمایشگاهی بی خطر است.

ژل آگارز توسط نور UV روشن می‌شود، که باعث می شود DNA یا RNA رنگ آمیزی شده با رنگ فلورسنت درخشنده شود و امکان تجسم نوارهای جدا شده را فراهم می‌کند.

2- برخی از خواص کلیدی ژل پلی آکریل آمید:

• ژل پلی آکریل آمید یکی دیگر از محیط‌های پرکاربرد در الکتروفورز ژل است که به ویژه برای کاربرد آن در جداسازی پروتئین‌ها و قطعات کوچک‌تر DNA یا RNA شناخته شده است.
• یکی از مزایای اصلی ژل‌های پلی آکریل آمید، قابلیت کنترل دقیق اندازه منافذ است. این امر با تغییر غلظت آکریل آمید و عامل ایجادپیوند عرضی، بیس اکریل آمید به دست می‌آید. غلظت‌های بالاتر منجر به اندازه منافذ کوچک‌تر می‌شود که برای جداسازی مولکول‌های کوچک‌تر ایده آل است.
• ژل‌های پلی آکریل آمید وضوح بالایی برای جداسازی مولکول‌ها ارائه می‌دهند.
• ژل‌های پلی آکریل آمید شفاف هستند و امکان مشاهده‌ی آسان نوارهای رنگ‌آمیزی شده را فراهم می‌کنند.

شماتیک از الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (PAGE)، سمت چپ دستگاه الکتروفورز را با یک ژل بین دو الکترود نشان می‌دهد: یک آند (+) و یک کاتد(-)، پروتئین‌ها معمولاً تحت شرایط ایجاد شده در PAGE دارای بار منفی هستند و بنابراین با اعمال جریان الکتریکی به سمت آند مهاجرت می‌کنند.

SDS-PAGE

در این روش اساس جداسازی جرم مولکولی نسبی می‌باشد و دیگه بار تأثیری ندارد. پروتئین‌ها در کنار ماده آمفی‌پات سدیم دودسیل سولفات (SDS) قرار داده می‌شوند و SDS به پروتئی‌ها متصل می‌شود و آن‌ها را در هر شکلی که باشند، به شکل میله‌ای درمی‌آورد. وصل شدن SDS باعث می‌شود که بار سطحی پروتئین یک دست منفی شود و از طرفی دانسیته بار در سطح پروتئین یکنواخت می‌شود.

الکتروفورز عمودی ژل پلی آکریل آمید

الکتروفورز ایزوالکتریکی

در این روش از خاصیت pH محیط استفاده می‌کنند تا نمونه‌ها را جدا کنند. در اصل ژل مورد استفاده در این روش یک شیب یا گرادیانی از pH دارد؛ یعنی قسمت‌های مختلف ژل از پایین به بالا از درجه اسیدی کم تا زیاد تغییر می‌کند.

 وقتی نمونه درون ژل حرکت می‌کند باردار است و براساس نسبت بار به جرمش پیش می‌رود. تا جایی که pH ایزوالکتریکش برابر با pH منطقه‌ای از ژل شود. در نهایت آن جا می‌ایستد.

یکی از مهم‌ترین کاربردهای این روش جدا کردن ایزوآنزیم‌ها است.

کاربرد دیگه الکتروفورز ایزوالکتریک در پروتئومیکس یا مطالعه پروتئوم یا محتوای پروتئینی سلول‌ها است. البته نه به تنهایی، بلکه به صورت ترکیب با الکتروفورز دوبعدی. حسن این روش، توان بالای آن در تفکیک پروتئین ها می‌باشد.

روش کار این الکتروفورز این است که پروتئین‌های استخراج شده از یک سلول یا بافت را اول بر مبنای بار الکتریکیشان توسط الکتروفورز ایزوالکتریک جدا می‌کنند. سپس ژل را ۹۰ درجه می‌چرخنند و پروتئین‌ها را با ژلی که حاوی SDS است الکتروفورز می‌کنند و این بار پروتئین‌ها بیشتر بر اساس جرم جدا می‌شوند. این طور یک نقشه دو بعدی از پروتئین تولید می‌شود که پر از نقاطی است که هر کدام نشان دهنده یک پروتئین است.

تهیه ژل آگارز

۱- تعیین غلظت ژل: غلطت آگارز در ژل به اندازه قطعات DNA که می‌خواهیم جدا کنیم بستگی دارد. غلظت‌های رایج بین 0.5 تا 2 درصد است.

۲- پودر آگارز را وزن کنید: مقدار مناسب پودر آگارز را بر اساس غلظت مورد نظر خود وزن کنید. به عنوان مثال، برای تهیه ژل 1 درصد، به ازای هر 100 میلی لیتر بافر، 1 گرم آگارز وزن کنید.

۳- افزودن بافر و گرما: پودر آگارز را به بافر الکتروفورز، معمولاً TAE (Tris-acetate-EDTA) یا TBE (Tris-borate-EDTA) اضافه کنید. مخلوط را در مایکروویو یا روی صفحه داغ گرم کنید، گاهی اوقات آن را بچرخانید تا آگارز کاملاً حل شود. مراقب باشید که از جوشیدن خودداری کنید.

۴- محلول را خنک کنید: اجازه دهید محلول تا حدود 55-60 درجه سانتیگراد خنک شود. این کار را می توان با گذاشتن آن در دمای اتاق انجام داد.

تهیه ژل پلی اکریل آمید:

۱- تعیین غلظت ژل: غلظت مناسب آکریل آمید را برای کاربرد خود انتخاب کنید. درصدهای بالاتر برای مولکول‌های کوچک‌تر استفاده می‌شود در حالی که درصدهای کمتر برای مولکول‌های بزرگ‌تر است.

۲- حلال‌ها را آماده کنید: حجم مناسب محلول آکریل آمید/بیس آکریل آمید، Tris-HCl (با pH معمولاً حدود 8.8)، SDS و آب را مخلوط کنید.

سپس مخلوطی مشابه اما با Tris-HCl با PH پایین (حدود 6.8) آماده کنید.

۳- افزودن بافر : بافر مورد استفاده در این ژل معمولا TBE است.

۴- پرسولفات آمونیوم (APS) و TEMED را اضافه کنید تا پلیمریزاسیون ژل سریع‌تر انجام شود.

الکتروفورز مولکول‌های DNA

نمونه‌های DNA با یک بافر بارگذاری (loading buffer) مخلوط می‌شوند که چگالی نمونه را افزایش می‌دهد و یک رنگ ردیابی برای نظارت بر پیشرفت الکتروفورز اضافه می‌کند. سپس نمونه‌ها و DNA ladder (مرجع تعیین سایز) با دقت در چاهک‌های ژل بارگذاری می‌شوند. ژل در مخزن الکتروفورز قرار می‌گیرد و جریان الکتریکی اعمال می‌شود. مولکول‌های DNA دارای بار منفی هستند، بنابراین به سمت الکترود مثبت (آند) حرکت می‌کنند. ژل به عنوان یک غربال مولکولی عمل می‌کند و به قطعات کوچک‌تر DNA اجازه می‌دهد سریع‌تر از قطعات بزرگ‌تر حرکت کنند. پس از الکتروفورز، DNA اغلب با رنگی مانند اتیدیوم بروماید رنگ‌آمیزی می‌شود که بین بازهای DNA قرار می‌گیرد و تحت نور UV فلورسانس می‌کند و امکان مشاهده نوارهای DNA را فراهم می‌کند.

افزودن نمونه به چاهک‌های ژل آگارز

رنگ آمیزی ژل یک مرحله ضروری در الکتروفورز DNA برای تجسم نوارهای DNA است، زیرا DNA در شرایط نور طبیعی قابل مشاهده نیست.

دو رویکرد اصلی برای رنگ آمیزی وجود دارد:

• رنگ‌آمیزی پس از الکتروفورز: پس از اجرای ژل، ژل را برای مدتی (اغلب 30 دقیقه تا یک ساعت) در محلول رنگ‌آمیزی خیسانده و سپس در آب یا محلول رنگ‌آمیزی رنگ‌آمیزی می‌کنند. این روش معمولا از اتیدیوم بروماید و برخی از جایگزین‌های آن (SYBR Safe، GelRed و GelGreen) استفاده می‌شود.
• رنگ آمیزی Pre-Casting: در این روش قبل از ریختن ژل، رنگ مستقیماً به محلول آگارز اضافه می‌شود.