در بخش قبلی با بیدهای مغناطیسی و انواع پوشش‌ها و کاربردهای آن آشنا شدیم. در این مطلب به بررسی کاربرد بیدهای مغناطیسی در NGS می‌پردازیم.
با AMINBIC همراه باشید.
بیدهای مغناطیسی برای توالی یابی نسل بعدی (NGS)
بیدهای مغناطیسی در مراحل مختلف NGS کاربردهای زیادی دارند. آن‌ها برای جداسازی و خالص‌سازی اسیدهای نوکلئیک و همچنین برای انتخاب اندازه مناسب در طول آماده‌سازی کتابخانه NGS و نرمال‌سازی کتابخانه ضروری هستند. بیدهای مغناطیسی با برچسب (تگ) استرپتاویدین برای غنی سازی هدفمند (target enrichment) و جذب ترکیبی (hybrid capture) مورد استفاده قرار می‌گیرند.
استخراج DNA و RNA با استفاده از شیمی نمکهای کائوتروپ (chaotropic)
رزین‌های سیلیکا یا بیدهای مغناطیسی پوشانده شده با سیلیس از نمکهای کائوتروپ برای شکستن پیوندهای هیدروژنی و اتصال اسیدهای نوکلئیک استفاده میکنند که این فرآیند به جداسازی آلاینده‌ها کمک می‌کند. عوامل کائوتروپ به دهیدراسیون DNA کمک میکنند و اتصال آن به بیدها را با پل زدن بین سطح بید و اسید نوکلئیک با کاتیون‌های دو ظرفیتیشان تسهیل میکنند. این فرآیند برگشت پذیر، بارهای منفی روی سطح بید و اسید نوکلئیک را خنثی می‌کند.
گوانیدینیم تیوسیانات اغلب در بافر لیز به عنوان یک دناتورانت قوی که فعالیت RNase و DNase را مهار می‌کند، استفاده میشود. دی تیوتریتول برای کاهش فعالیت پروتئین استفاده میشود، در حالی که گلیکوژن به رسوب اسیدهای نوکلئیک کمک می‌کند.
اتصال اسید نوکلئیک به بیدها در شرایط غلظت بالای نمک، زمان انکوباسیون طولانی‌تر و افزایش حجم بید، افزایش مییابد. عوامل کائوتروپیک به دهیدراسیون DNA و اتصال آن به سطح بیدها کمک میکنند و پوشش‌های عملکردی بیدها از طریق فعل و انفعالات الکترواستاتیکی یا جاذبه‌هایی که به سطح نمک یا pH وابسته هستند، عمل میکنند. با اتصال الیگونوکلئوتیدهای خاص به سطح بیدها، میتوان زیرمجموعه‌های خاصی از اسید نوکلئیک را جدا کرد.
عوامل کائوتروپیک در استخراج اسید نوکلئیک با بیدهای مغناطیسی
پس از اینکه نوکلئیک اسید به بیدها متصل میشود، با غلظت‌های مختلفی از بافر مبتنی بر اتانول شستشو می‌شوند تا ناخالصی‌ها حذف شوند. سختی بافر و شست و شو بر اساس سطح آلودگی قابل تنظیم است.
استخراج اسید نوکلئیک در یک بافر شستشوی مناسب یا آب انجام میشود. این کار با گرم کردن آن در دمای بالا (65 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه یا 80 درجه سانتیگراد در موارد خاص) برای اطمینان از بازیابی بهتر انجام میشود. در روش‌های خودکار با توان بالا، میتوان بافر شستشو را قبل از افزودن به بیدها گرم کرد تا راندمان شستشو را بهبود بخشد.
روش‌های مبتنی بر بید برای خالص‌سازی DNA، DNA پلاسمیدی، RNA، و اسیدهای نوکلئیک از ویروس‌ها یا باکتری‌ها که با PCR تکثیر شده‌اند برای کاربردهای مختلف استفاده می‌شوند.
بیدهای مغناطیسی برای تهیه کتابخانه توالی یابی نسل بعدی (NGS)
آماده سازی کتابخانه NGS شامل تجزیه DNA، افزودن توالیهای آداپتور، انتخاب اندازه قطعات و کنترل کیفیت (QC) کتابخانه است.
انتخاب اندازه یک مرحله حیاتی است که موفقیت مراحل بعدی را تعیین می‌کند و میتوان با استفاده از بیدهای مغناطیسی اندازه مناسب را به دست آورد. به طور معمول، ابتدا قطعات بزرگ (بیش از 400 جفت باز) که با clustering تداخل دارند، حذف می‌شوند و سپس تمام قطعات زیر 150-200 جفت باز حذف می شوند. سپس قطعه با اندازه مورد نظر به بیدها متصل شده، شسته و استخراج میشود.
انتخاب اندازه ممکن است تحت تأثیر نحوه قطعه قطعه شدن DNA قرار گیرد؛ اگر پروتکل سونیکاسیون نامناسب باشد، انتخاب اندازه ممکن است ناکارآمد باشد. اندازه قطعات جدا شده را میتوان با تغییر نسبت حجم بید به نمونه کنترل کرد و انعطاف پذیری در سفارشی سازی پروتکل ارائه داد. برای اتصال موثر، مخلوط بید-نمونه باید حداقل به مدت پنج دقیقه انکوبه شود.
در طول شست و شو، بیدها باید در میدان مغناطیسی باشند تا از آلودگی ناشی از الکل باقی‌مانده در بافر شست و شو که می‌تواند در توالی‌یابی اختلال ایجاد کند، جلوگیری شود. بنابراین خشک کردن نمونه‌ها را در انتهای فرایند شستشو با هوا بسیار مهم است و از انتقال آلودگی به مراحل بعد جلوگیری می‌کند.
همچنین در پروتکل‌های RNA-seq، بیدهای مغناطیسی برای حذف انواع خاصی از RNA مانند rRNA یا غنی‌سازی سایرین، مانند mRNA بسته به نیاز آزمایش استفاده میشود.
نرمال سازی کتابخانه با بیدهای مغناطیسی
روش نرمال‌سازی کتابخانه با استفاده از بیدهای مغناطیسی بر مبنای این ایده عمل می‌کند که یک حجم مشخص از بیدها می‌تواند به مقدار ثابتی از مولکول‌های اسید نوکلئیک متصل شود. به عبارت دیگر، اگر تعداد کافی از مولکول‌ها در هر کتابخانه وجود داشته باشد تا بیدها را اشباع کنند، اکثر قطعات کتابخانه از هر نمونه به بید متصل و نگه‌داری می‌شوند.
سپس تمام مولکول‌های غیرپیوندی شسته می‌شوند تا هر کتابخانه تنها شامل مولکول‌هایی باشد که به بید متصل هستند. سپس نمونه نرمال شده، برای اضافه کردن به کتابخانه، از بیدها شسته میشود.
برای هر کاربرد، می‌توانید از بیدهای مغناطیسی با پوشش‌های متفاوت استفاده کنید. این گزینه‌ها عبارتند از:
- بیدهای مغناطیسی با پوشش کربوکسیل و سیلیس: برای اتصال عمومی و غیر اختصاصی مولکول‌ها بر اساس شرایط بافر
- بیدهای مغناطیسی با پوشش oligo(dT) برای اتصال به mRNA
- بیدهای مغناطیسی با پوشش استرپتاویدین: برای اتصال به نمونه‌های بیوتینیله
اما باید به یاد داشت که استفاده از رویکرد مبتنی بر بیدها باید با دقت انجام شود: تعداد مولکول‌ها در هر کتابخانه باید برابر یا بیشتر از ظرفیت اتصال بیدها باشد و مقدار اضافی آن دور ریخته شود. اگر نمونه شما ارزشمند یا محدود است، بهتر است که زمان بیشتری را برای کمی سازی مبتنی بر qPCR صرف کنید.
غنی سازی هدف و جذب هیبرید با استفاده از بیدهای استرپتاویدین
بیدهای مغناطیسی تگ شده با استرپتاویدین به دلیل تمایل قوی آن به بیوتین (که قوی‌ترین برهمکنش بیولوژیکی غیرکووالانسی است) در توالی یابی اگزوم و توالی‌یابی هدفمند به طور فزاینده‌ای استفاده می‌شوند. در این فرآیند، DNA ژنومی بریده شده با پروبهای بیوتینیله مخصوص هدف گرفته میشود. این پروبها توالیهای مکمل DNA یا RNA هستند که به مناطق هدف متصل می‌شوند و DNA هیبریدی را تشکیل می‌دهند. این DNA هیبرید با بیدهای مغناطیسی تگ شده با استرپتاویدین گرفته میشود، با جذب مغناطیسی خالص میشود، سپس DNA هدف شسته و برای آماده سازی کتابخانه و تعیین توالی نهایی استفاده میشود.
در انتخاب بیدها و طراحی آزمایش خود، برخی نکات را به خاطر داشته باشید:
- تجزیه و تحلیل جامع انواع مختلف تغییرات نوکلئوتیدی از طریق غنی‌سازی هدف مبتنی بر جذب ترکیبی
- اهمیت برش یکنواخت DNA ژنومی و انتخاب اندازه قطعه برای اتصال پروب خاص.
- قطعات کوچکتر نسبت به قطعات بزرگ با دقت بیشتری به پروبها متصل می‌شوند. بنابراین، برش یکنواخت و انتخاب اندازه قطعات برای افزایش کارایی یک آزمایش مهم است.
- پروبهای سنتزشده به صورت یکنواخت کارآیی توالی‌یابی را بهبود میبخشند.
- پروبهای دو رشته‌ای با فراهم کردن شانس بیشتر برای گرفتن یک قطعه، کارایی گرفتن قطعه مورد نظر را به حداکثر می‌رسانند.
- تکثیر و تقویت DNA قبل از هیبریداسیون، برای نمونه‌هایی با کیفیت و یکپارچگی پایین، مانند نمونه های بالینی و aDNA توصیه میشود.
- برای به حداکثر رساندن اختصاصیت و کارایی، DNA و پروب را در یک محیط بدون نمک هیبرید کنید.
- همیشه قبل از شستشو و استحصال DNA هدف، DNAهای غیرمتصل را شستشو دهید.
تهییه و تنظیم از:
- مهسا خباز
- سویل راجی
