در مطالب قبل، با بیدهای مغناطیسی و کاربرد آن‌ها در NGS آشنا شدیم. در این مطلب به بررسی کاربرد این بیدها برای تخلیص پروتئین و همچنین سنجش ایمنی (immunoassays) می‌پردازیم.
با AMINBIC همراه باشید…
بیدهای مغناطیسی برای تخلیص پروتئین
از بیدهای مغناطیسی برای تخلیص تک پروتئینها (single proteins)، کمپلکسهای بزرگ پروتئینی، آنتیبادی‌ها و برای تخلیص با توان بالا (high-throughput) استفاده میشود. آن‌ها عملکرد رزین‌های کروماتوگرافی را با سادگی استفاده از بیدهای مغناطیسی ترکیب می‌کنند. برای مثال بیدهای مغناطیسی سفارز جایگزین خوبی برای ستون‌های سفارز سنتی هستند. بیدها با داشتن طیفی از لیگاندها، فرآیند آماده‌سازی نمونه‌های پروتئینی و پپتیدی را برای آنالیز‌های بعدی ساده‌تر می‌کنند.
کارکردن با بیدهای مغناطیسی برای تخلیص پروتئین
- برای شروع، تنظیم حجم بید به پروتئین در ماده اولیه بسیار مهم است.
- مواد دارای میل ترکیبی کم، ظرفیت اتصال را کاهش می‌دهند و سایت‌های اتصال اضافی می‌توانند سیگنال‌های غیر اختصاصی را در هنگام اشباع شدن سایت‌ها، تقویت کنند.
- اندازه مولکول زیستی بر میزان اتصال به هر بید تأثیر می‌گذارد. تعداد بیشتری از مولکولهای زیستی کوچک نسبت به مولکولهای زیستی بزرگ‌تر، به هر بید اتصال پیدا میکند.
- اندازه کوچک بیدها باعث ایجاد مساحت بیشتری برای اتصال میشود و همچنین ظرفیت اتصال برای مولکولهای بزرگ نیز افزایش می‌یابد.
- برای نمونه‌های رقیق‌شده مانند سوپرناتانت‌های سلولی یا پروتئین‌های با فراوانی کم، حجم‌های بیشتری از نمونه باید روی حجم‌های به نسبت کوچک‌تری از بیدها اعمال شود یا نمونه‌ها باید تغلیظ شوند. افزایش زمان انکوباسیون نمونه با بیدها یا افزودن گلیسرول به نمونه‌ها می‌تواند اتصال غیر اختصاصی را کاهش دهد.
- تگهای با میل ترکیبی بالا را انتخاب کنید (GST، His و استرپتاویدین) و در عین حال مطمئن شوید که آن‌ها به طور خاص فقط در پروتئین مورد نظر شما بیان می‌شوند. برای شست و شو، از یک بافر حاوی لیگاندهایی که میل ترکیبیشان به بیدها، بالاتر از پروتئین شما است، یا بافری با pH بالاتر استفاده کنید.
بیدهای مغناطیسی برای تخلیص پروتئین
بیدهای مغناطیسی برای سنجشهای ایمنی (immunoassays)
بیدهای مغناطیسی در سنجش ایمنی برای شناسایی اهداف، انجام آزمایش‌های pull-down و مطالعه برهمکنش‌های پروتئین-پروتئین و پروتئین-DNA بسیار مؤثر هستند.
بیدهای مغناطیسی اغلب با افزودن BSA، شیر بدون چربی، DNA اسپرم، ژلاتین، PEG یا سرم درمان (treat) می‌شوند تا اتصالات غیراختصاصی ناخواسته حذف شود اما بیدهای بلوکه شده با استرپتاویدین آماده استفاده هستند که نیاز به این مواد افزودنی را از بین می‌برد.
اگر از یک عامل مسدود کننده استفاده میشود، بیدها را با بافر لیز و مقدار کمی عامل بلوکه کننده متعادل کنید و همان عامل را در بافر شست و شو قرار دهید تا از اتصال غیر اختصاصی جلوگیری شود. پیش درمان (pretreatment) محلول با بیدها قبل از افزودن آنتی بادی نیز می‌تواند به کاهش اتصال غیر اختصاصی کمک کند.
انتخاب آنتی بادی یک مرحله بسیار مهم در سنجش ایمنی است. آنتی بادی را با استفاده از ایمونوبلات استاندارد تست کنید تا عدم اختصاصی بودن آن را بررسی کنید. انتخاب یک آنتی بادی اختصاصی و یک بید با میل ترکیبی بالا می‌تواند حساسیت یک آزمایش را تا حد زیادی افزایش دهد. برای بهینه سازی تشخیص آنتی ژن و انتخاب موثرترین ترکیب، تگ‌ها و آنتی بادی‌های مختلف را آزمایش کنید.
آنتی بادی اضافی می‌تواند بدون اتصال باقی بماند و منجر به ایجاد نویز شود، در حالی که غلظت‌های ناکافی بیدها را به طور یکنواخت پوشش نمی‌دهد و می‌تواند اتصال هدف را کاهش دهد. آلودگی‌های ناشی از زنجیره‌های سبک و سنگین آنتی بادی‌ها را می‌توان با استفاده از اتصال عرضی بیدمغناطیسی-آنتی بادی و شست و شو در pH پایین و بافر غیر کاهنده از بین برد.
موفقیت اتصال آنتی ژن به آنتی بادی به سطوح بیان آنتی ژن بستگی دارد که باید برای آنتی ژن‌های مختلف و غلظت آنتی بادی خاص استاندارد شود.
بیدهای مغناطیسی برای تخلیص پروتئین
چند نکته برای انتخاب بید موثر و طراحی آزمایشی:
- برای آنتی ژن‌های کمیاب، زمان اتصال را افزایش دهید (این می‌تواند اتصال غیر اختصاصی را نیز افزایش دهد) و نمونه‌ها را تغلیظ کنید.
- برای هدفهای با فراوانی بالا، غلظت آنتی بادی یا سطح بید را افزایش دهید.
- اتصال آنتی ژن به کمپلکس بید-آنتی بادی اختصاصی‌تر از اتصال کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی به بید است.
- برای کاهش اتصال غیر اختصاصی، مواد شوینده را در بافر اتصال (binding) قرار دهید.
- برای ایجاد اتصال در دمای اتاق، مدت زمان 10 دقیقه کافی است اما در برخی موارد، اتصال آهسته‌تر در دمای 4 درجه سانتیگراد در مدت زمان 4 ساعت، ممکن است مفید باشد.
- تمام مراحل آزمایش را می‌توان روی یخ انجام داد تا عدم اختصاصی بودن کاهش یابد؛ مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد.
- برای جلوگیری از جداشدن آنتی بادی از بیدها، به جای 95 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد شست و شو را انجام دهید.
- برای سنجش ایمنی ساندویچی، بیدهای دهنده و گیرنده باید به دقت طراحی شوند تا به یکدیگر متصل نشوند. بیدهایی را انتخاب کنید که به طور مشخص در طول موج تحریک و انتشار و ویژگی اتصال به آنتی ژن مربوطه متفاوت هستند و تحت تأثیر تداخلات خاص نمونه یا بافر قرار نمی‌گیرند. برای جلوگیری از بارگذاری بیش از حد بیدها و کاهش سیگنال‌ها از غلظت‌های بالای بیومولکول اجتناب کنید.
سنجشهای تشخیصی مولکولی که از اولیگوهای خاص متصل به بیدها برای گرفتن توالی استفاده می‌کنند
بیدهای مغناطیسی متصل به پروب‌های با توالی خاص در سنجشهای تشخیصی مولکولی، برای تشخیص پلی مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی و نشانگرهای زیستی ژنتیکی بیماری‌های زمینهای استفاده میشود.
این تکنیک همچنین به تجزیه و تحلیل DNA بدون سلول (cfDNA) در مایعات مختلف بدن و تشخیص عفونت‌های باکتریایی یا ویروسی با استفاده از پروب‌های مکمل کمک میکند. بیدهای متصل به پروب‌های مورد نظر را می‌توان به تولیدکننده سفارش داد و یا می‌توان آن‌ها را درآزمایشگاه تهیه کرد.
چالش‌های کلیدی در نمونه‌های تشخیصی شامل آلودگی، کمیت متغیر DNA/RNA، تخریب و حضور مهارکننده است.
برای بازیابی بهتر اسید نوکلئیک، اطمینان از سالم بودن نمونه و پردازش سریع نمونه‌های خون، ادرار و پلاسما ضروری است.
اختصاصیت و کارایی بیدها در تشخیص بستگی به پروب انتخابی، زمان انکوباسیون و فراوانی نمونه دارد. برای گرفتن نتیجه بهتر، پروب‌هایی با اختصاصیت بالا و غیر همپوشان طراحی کنید.
باید زمان انکوباسیون اسید نوکلئیک با بیدها، برای اتصال موثر و تشخیص با حساسیت بالا استاندارد شود.
در مورد نمونه‌هابی با فراوانی کم، تقویت PCR یا غلظت نمونه می‌تواند کارایی تشخیص را افزایش دهد.
بیدهای مغناطیسی متصل به پروبها و یک نانوپلتفرم پراکندگی رامان تقویت‌شده سطحی (SERS)، روشی سریع در تشخیص مولکولی ارائه می‌کنند.
تهییه و تنظیم از:
- سویل راجی
- مهسا خباز
